Összefoglaló:
A tüskefehérje egy szuperantigén amiloidfehérje, ami - sok más mellett - amiloidózist is okoz.
Az amiloidózis rendellenes fehérjéknek a különböző szövetekben történő felhalmozódását jelenti, két nagy csoportja van: szisztémás (több szervet érintő) és helyi (lokális).
Amiloidok felhalmozódhatnak az agyban (Alzheimer, egyes demenciák stb.), különféle szövetekben (szív, vese, bőr, érfalak stb.), ennek megfelelően változatos tüneteket okoznak.
A génterápiák során a génterápiával injektáltak (Sputnik, Moderna, Janssen, Pfizer és Astra-Zeneca Magyarországon) sejtjei az amiloidózist is okozó tüskefehérjét termelik ismeretlen ideig, de bizonyosan hónapokig.
Korábban is folytak kutatások arra, hogy mesterségesen előidézzenek amiloidózist.
Az, hogy a tüskefehérje amiloidképző, tanulmányok bizonyítják.
Az amiloidózis diagnosztizálása és terápiája komoly kihívás elé állítja az egészségügyet.
Bevezető
Walter M. Chestnut írása nyomán.
Walter Chestnut Parsifaler néven futott a Twitteren, amíg örökre nem tiltották, az amiloidos tweetje miatt. Tanulmányozva a COVID19 elleni génterápiák emberekre gyakorolt hatását arra jutott, hogy a tüskefehérje egy olyan antigén, ami (a daganatos megbetegedéseken, az immunrendszer megborulásán és AIDS-en, valamint a reaktivált DNS vírusokon kívül, amelyről ezen a linken hallhattok Dr. Malonétól) amiloidózist is okoz az embereknél. Miért érdekes ez? Mert egyrészt iránymutatást ad lehetséges terápiák felé, másrészt megmagyarázza azokat a rendkívül változatos tüneteket, amelyeket az oltáskárosultak tapasztalnak meg.
Erről ebben a bejegyzésben olvashatsz bővebben:
Parsifalert mindenesetre nem hagyta nyugodni a dolog, ezért áttekintette azt, milyen kutatások folytak azzal kapcsolatban, hogy amiloidózist idézzenek elő emberekben, állatokban.
Erről olvashattok most, valamint arról, hogy megjelent egy nagyon alapos tanulmány, amely alátámasztja és bizonyítja azt, hogy a tüskefehérje - ergo a génterápiákkal termeltetett tüske is - amiloidózist okoz.
II. Az amiloidózis mesterséges előidézésére irányuló kísérletek
Parsifaler:
Ez az eddigi legfontosabb felismerésem.
Úgy gondolom, hogy ma este sikerült jelentős áttörést elérnem. Amiatt, mert biztos vagyok abban, hogy a COVID19 betegséggel kapcsolatban egy laboratóriumban létrehozott olyan kórokozóval van dolgunk, amely amiloidózist idéz elő az emberben (és az is lehet, hogy más fajoknál is?), úgy döntöttem, hogy utánanézek annak, mit csináltak a múltban, mert azt feltételezem, hogy azokat a mechanizmusokat, amiket keresek, nem hiszem, hogy meg lehet találni az amiloidózis természetes patogenezisében.
És valóban, az amiloidózisnak a kísérleti állatokban történő előidézésének hosszú történelme van.
Menjünk vissza 1965-be. Ebben az évben az American Journal of Pathology című folyóiratban megjelent egy tanulmány, amelynek egyszerűen csak azt a címet adták, hogy "Kísérleti amiloidózis." Ez a publikáció bebizonyította, hogy olyan egereknél, akiket 3-4 héten keresztül hetente hét napon át ismételten injekcióztak kazeinnel, mindnél amiloidózis alakult ki. Az amiloidózis kialakulását konkrétan a kazein antigén jellegének tulajdonították.
Ma már azonban tudjuk, hogy a kazeinnek van egy nagyon különleges tulajdonsága. 2013-ban a Protein Nanotechnology (!) című folyóiratban megjelent egy tanulmány. Ez a cikk leírja, hogy a kazeinfehérjék képesek önmagukat amiloid fonalakba rendezni.
Ami ennél még fontosabb, hogy a tüskefehérje is képes amiloid fibrinekké szerveződni.
Van egy másik mechanizmus is, ami szerintem ugyancsak szerepet játszik.
Állítsuk az órát előre. Ezúttal az 1992-es évre. Ebben az évben a Guangdong Tartományi Baromfitenyésztési Tudományos Kutatóintézet megjelentetett egy rövid közleményt Amyloidózis kísérleti előidézése kacsákban címmel.
A kacsákat ismétlődően vagy E Coli vagy a Salmonella Tryphimurium vagy mindkettő extraktumával inokulálták. Az eredmény az volt, hogy a kacsák 30-60%-ánál a különböző szövetekben amiloid lerakódások alakultak ki. A szerzők két fő következtetése szerint az amiloidózist "az immunrendszer zavara" idézte elő, és hogy az amiloidózis "antigének általi túlstimuláció" eredményeként alakult ki.
A tüskefehérjével kapcsolatos problémák sokkal súlyosabbak. A tüskefehérje egy szuperantigén, és önmagában is amiloidogén. Ez minden bizonnyal felgyorsítja és fokozza az amiloidózis indukciójának és progressziójának súlyosságát.
Ezzel kapcsolatban, hogy a tüskefehérje maga is szuperantigén, Parsifalertől itt olvashattok:
Azt, hogy a tüskében milyen szuperantigén szekvenciák vannak A SARS-CoV-2 tüske egyedi inzertjének szuperantigén jellege, amelyhez ferde TCR-repertoár társul a hiperinflammációban szenvedő betegeknél címmel lefordítottam egy izgalmas cikket, így magyarul is elérhető.
III. Az elméletet bizonyító tanulmány
Ezt a Parsifaler elméletét alátámasztó és bizonyító tanulmányt pedig pár órája jelentették meg.
A cikket úgy olvassátok, hogy abban a szerzői kizárólag a COVID19 betegséget emlegetik. Nyilván szerették volna megjelentetni a cikket, ezért a génterápiákról nem ejthettek szót - a cenzúra miatt.
Hangsúlyozzuk, hogy az a fehérje, amiről beszélnek, amivel a kísérleteket végezték és amiloidokat állítottak elő, ez az a tüskefehérje, amelyet az emberi sejtek a génterápiás injekciókat követően termelnek.
Következzék maga a tanulmány:
A SARS-CoV-2 tüskefehérje amiloidogenezise
A SARS-CoV2 fertőzés meglepően sokféle betegséggel társul. Az amiloid-betegséghez társuló véralvadási és fibrinokus zavarok, valamint a neurológiai és szívproblémák kísérteties hasonlóságai vezettek bennünket a SARS-CoV2 tüskefehérje (S-fehérje) amiloidogenitásának vizsgálatára. A peptidkönyvtárak keverékein végzett amiloid fibrillakísérletek és az elméleti előrejelzések hét amiloidogén szekvenciát azonosítottak az S-fehérjén belül. Mind a hét peptid izolálva aggregátumokat képzett 37 °C-on történő inkubáció során. Három 20 aminosav hosszú szintetikus tüskepeptid (192-211, 601-620, 1166-1185 szekvencia) három amiloidfibrillum-kritériumot teljesített: nukleációfüggő polimerizációs kinetika ThT-vel, Kongó-vörös pozitivitás és ultrastrukturális fibrilláris morfológia. A teljes hosszúságú, összehajtogatott S-fehérje nem képzett amiloid fibrillákat, de 24 órás S-fehérje és a proteáz neutrofil elasztáz (NE) in vitro koinkubációja során egyértelműen elágazó, amiloidszerű fibrillák keletkeztek. Az NE hatékonyan hasította az S-fehérjét, ami az amiloidogén szegmensek expozícióját és a 194-203-as amiloidogén peptid felhalmozódását eredményezte, amely a leginkább amiloidogén szintetikus spike peptid része. A vírusos fertőzés gyulladt helyein a NE túlexpresszálódik. Adataink egy olyan molekuláris mechanizmusra utalnak, amely szerint az emberekben a SARS-CoV-2 S-fehérje endoproteolízis által elősegített amiloidogenezisének történik. Az S-fehérje amiloidogenezisének perspektivikus szerepe a COVID-19 betegséggel kapcsolatos patogenezisben fontos lehet a betegség és a hosszú COVID-19 megértésében.
A koronavírusok a homotrimer felszíni tüskefehérjét (S-fehérje) használják az emberi sejtekhez való kapcsolódáshoz. A SARS-CoV-2 S-fehérje alegységek mindegyike 1273 aminosavat tartalmaz. (1) Négy gyakori koronavírus (OC43, 229E, NL63 és HKU1) fertőzi az embert és kolonizálja a légutakat. A közelmúltban megjelent SARS, a MERS és 2019 óta a SARS-CoV-2 is súlyos megbetegedést eredményez. Bár a koronavírus-fertőzések gyakoriak, a COVID19 előtt nem számoltak be a légutakon kívüli szerveket is érintő komplex tünetek ilyen széles körű elterjedéséről. A COVID-19 patogenezise multifaktoriális és összetett. (2) A súlyos COVID19 magában foglalja a tüdőkárosodáshoz vezető veleszületett immunrendszeri gyulladásos reakciókból eredő akut légzési distressz szindrómát (ARDS); (3) a citokinvihart; (4) a szívkárosodást, beleértve a szívizom gyulladását; vesekárosodást; az idegrendszer károsodását; a keringési rendszer rossz véráramlást eredményező károsodását. A Long-COVID19 tünetei közé tartoznak a tartós pszichés betegségek és a neurodegeneratív betegségekre emlékeztető mentális állapotok. (2) Mi lehet ennek a patogenezisnek az alapja?
A számos bűnös fehérjéből származó amiloidózis szisztémás és lokalizált rendellenességek formájában jelentkezik, amelyeknek számos fenotípusa átfedésben van a COVID19 jelentette tünetekkel. Azt feltételezik, hogy a SARS-CoV-2 fehérjeaggregációval kombinált súlyos gyulladásos betegség, beleértve az ARDS-t is, szisztémás AA amiloidózist idézhet elő. (5) Az idegrendszeri degenerációval összefüggésben felmerült az S-fehérje amiloidfibrillumok neurotropikus kolonizációja és keresztszóródása az endogén fehérjék aggregációjának indukálása érdekében. (6) Figyelemre méltó, hogy COVID19 betegeknél a véráramban lévő extracelluláris amiloidos fibrilláris aggregátumokkal összefüggő vérrögképződésről számoltak be. (7) Egészséges donorok vérplazmájában, amelyet kísérletileg S-proteinnel dúsítottak, hiperkoagulációt/károsodott fibrinolízist mutattak ki. (7)
Az amiloidózis agyi amiloid angiopátiával, véralvadási zavarral, fibrinolitikus zavarral, (8, 9) FXII Kallikrein/Kinin aktivációval és tromboinflammációval társul, (10) ami az S-protein amiloidogenezis és a COVID-19 fenotípusok közötti lehetséges kapcsolatra utal. Ezért feltételeztük az S-protein és az amiloidképződés közötti lehetséges molekuláris kapcsolatot. A humán és vírusfehérje-amiloidokkal és a közöttük lévő kölcsönhatásokkal, (11, 12, 13) különösen a SARS-CoV tüskefehérjékkel (6,14,15) kapcsolatos korábbi hipotézisek által inspirálva feltettük a kérdést: Vajon a SARS-CoV-2 S-fehérje amiloidogén?
A teljes SARS-CoV-2 S-fehérje (ProteinID: P0DTC2) peptidszkenneléséből 316 peptidpool könyvtárat nyertünk (két alegységre osztva) (Támogató információk). In vitro amiloid fibrillumok képződtek mindkét peptid alegységben (Támogató információk, S1 ábra). Az eredményeken felbátorodva 20-AA peptideket generáltunk a teljes hosszúságú SARS-CoV-2 S-proteinből. Célunk az volt, hogy a leginkább amiloidogén szekvenciákkal foglalkozzunk, és a WALTZ (https://waltz.switchlab.org/) predikciós algoritmust (16) használtuk az ilyen szegmensek azonosítására (1. táblázat, Támogató információk).
Hét amiloidogén szekvenciát azonosítottunk, amelyek a teljes S-fehérjében eloszlanak, és az S-fehérjében elfoglalt kiindulási pozíciójuk szerint neveztük el őket (S2. ábra, Támogató információk). Egy kivételével (Spike365) a sejthető szekvenciák mindegyike β-lap konformációban van a SARS-CoV-2 Spike krio-EM szerkezetben, zárt állapotban. (1) A fehérje C-terminális része (Spike1166) nincs a struktúrában rendezve.
Az oldott peptidek (0,1 mg/ml, PBS pH 7,5, 10% HFIP) in vitro amiloid fibrillaképződési kinetikáját ThT, kongóvörös kettőstörés (CR) és negatív festésű transzmissziós elektronmikroszkópia (TEM) segítségével követtük nyomon.
A legtöbb szintetikus peptidből származó fibrillákat néhány órán belül detektálták legalább egy vizsgálat során (1. táblázat, 1. ábra). A Spike192, a Spike601 és a Spike1166 minden amiloid kritériumunknak megfelelt: szigmoidális ThT kinetika, kongofilitás és fibrilláris ultrastruktúra (1. ábra, 1. táblázat). A Spike192 kivételesen jól rendezett fibrillákat képzett, amelyek az összes peptid keverékéhez hasonlíthatóak (1C. és S3C. ábra).
Mi a valószínűsíthető mechanizmusa az S-fehérje fibrillumok kialakulásának a SARS-CoV-2 fertőzés során? A SARS-CoV-2 S-protein meglehetősen stabil (Tm > 50 °C) (17), és nem könnyű spontán denaturálni. Továbbá, egy ilyen nagy, komplexen összeálló fehérje nem fog könnyen amiloidos állapotba bomlani. Mindazonáltal a proteolízis egy nyilvánvalóan szóba jöhető mechanizmus.
A prekurzor fehérjék endoproteolízise jól ismert molekuláris indító mechanizmus számos amiloidózisban, nevezetesen az Alzheimer-kórban (AβPP), a brit és dán demenciában (ABri/ADan) és a finn familiáris amiloidózisban (AGel). A teljes hosszúságú fehérjék proteolízise számos más amiloid betegségben is nyilvánvaló az ATTR, ALys, AA és ASem1 lerakódásokban. (18,19)
A SARS-CoV-2 S-fehérje a fertőzés során a gazdaszervezet furinszerű enzimei és a sejtfelszínen szerin proteázok, például a transzmembrán proteáz, szerin 2 (TMPRSS2) által proteolízisre kerül (20), és a gyulladás során további proteolízisre kényszerül.
A neutrofilek a leukociták domináns osztálya és az első válaszadó akut gyulladás során. A neutrofilek számos különböző légúti vírussal, köztük a SARS-CoV-2 vírussal fertőzött betegek bronchoalveoláris terébe toborzódnak. (21) A neutrofilek az oponálódott kórokozók fagocitózisával és olyan enzimek extracelluláris felszabadításával, mint a neutrofil elasztáz (NE), fejtik ki hatásukat. A NE egy szerinproteáz, amely olyan obstruktív tüdőbetegségekhez kapcsolódik, mint a cisztás fibrózis, a krónikus obstruktív tüdőbetegség, (22) és az alfa-1-antitripszinhiány. (23)
A SARS-CoV-2 S-fehérje aminosav-szekvenciáját in silico proteolitikus hasításnak vetettük alá NE által az Expasy Peptid vágó segítségével. Az így kapott peptidek egyike, a Spike194-213, nagyban megegyezett a Spike192-vel, csak két aminosavat eltolva a keretrendszerben (Támogató információk), amiből következik, hogy a hipotézis tesztelhető.
A teljes hosszúságú SARS-CoV-2 S-proteint in vitro NE hasításnak vetettük alá. Az S-fehérje komplex termikus kibomlást mutatott, többszörös átmenettel a 45-65 °C körül, és egy jelentős kibomlással járó átmenettel, amelynek denaturációs középpontja (Tm) 79 °C volt (2A és S4A ábra), a differenciális pásztázó fluorimetriával (DSF) (2. és S4 ábra), hasonlóan a teljes hosszúságú S-fehérjékre vonatkozó irodalmi értékekhez, (24) amely igazolta a kiindulási helyzetben összehajtogatott fehérje állapotát. Az S-fehérje hűtés után újra összehajtódott, bár nem együttműködve (2A. ábra). A NE irreverzibilisen kibomlott (Tm 59 °C) (2B ábra). A koinkubált S-fehérje+NE csak az NE esetében mutatott egyértelmű átalakulást, és hűtésre nem hajtódott vissza, ami arra utal, hogy az S-fehérjét az NE hasította (2C ábra). A tömegspektrometria igazolta az elpusztulást, mivel csak az S-protein+NE kísérlet mutatott ki peptidcsúcsokat (2D-F ábra).
A legfontosabb, hogy TEM segítségével amiloidszerű fibrillaképződést fedeztünk fel a proteolitikus hasítás után. Sem az NE, sem a SARS-CoV-2 S-protein önmagában inkubálva nem képzett fibrillákat (2G-H ábra). Fibrillumok csak a két fehérje együttes inkubálása után voltak kimutathatók (2I. ábra). A fibrillumok szokatlan morfológiát mutattak, nyilvánvaló elágazásokkal (2I. ábra), ami arra utal, hogy a fibrillumon belül proteolitikusan beékelődött S-fehérje is részt vesz, ami csomópontokat teremt a különböző amiloidogén szekvenciák elágazásához (2I. és S5. ábra).
Ezt követően LC-MS/MS analízist végeztünk az 1 perc és 6 óra lebontás után képződött peptidekből, 2:1 arányú NE és S-fehérje fölöslegben. Az S-fehérje szerkezetéből 98 NE hasadási peptidet azonosítottunk (S1 táblázat), és ezeket három csoportba soroltuk: (i) 1 perc után képződött (3A, B ábra), (ii) 1 perc után képződött és 6 óra után is jelen volt (3A, C ábra), és (iii) csak 6 óra után volt jelen (3A, D ábra). A kezdeti hasadás és a további lebontás (i. csoport) főként az S2 doménen belül történt, a HR domének és az S1 C-terminális részének gyakori hasadása mellett. Az NTD és az RBD sokkal kevésbé volt érintett (3A ábra). A kezdeti hasítás után keletkezett három tartós peptid (ii. csoport) az NTD-ből és az RBD-ből származott. Több peptid csak 6 órás inkubáció után képződött (iii. csoport). Feltűnő, hogy a 194-203-as szegmensből származó peptid (FKNIDGYFKI, a Spike192-ben szerepel) ebbe a csoportba tartozott, és 6 óra után nagy mennyiségben volt jelen (S2. táblázat). Három, a hét spike peptidünk szegmenseit tartalmazó peptid (3A, E ábra) szabad peptidként képződött (Spike192, Spike258 és Spike1166), amelyek még 6 órás koinkubálást követően is jelen voltak, kettő korán lebomlott és eltűnt (Spike532 és Spike685), kettő pedig valószínűleg még mindig jelen volt a nickelt S-szülőfehérjében (Spike365 és Spike601). Ennélfogva a megfigyelt elágazó fibrillumok (2I. és S5. ábra) valószínűleg olyan fibrillumok keverékéből állnak, amelyeket egy olyan, amyloidogén peptidmag indított el, amely a nyúlványos S-fehérjét megnyúlásra és elágazásra szervezi magába.
A többi spike peptiddel azonos fibrillációs kísérleteket végeztünk a 194-203-as rövid fragmentumon is (4A, B ábra). A peptid kevésbé volt amiloidogén, mint a Spike192 (1 mg/ml volt szükséges a fibrillumok kialakulásához, szemben a Spike192 0,1 mg/ml-ével) (4B ábra). A Spike194-203 képződött fibrillái azonban amiloidogénnek bizonyultak a három kritériumunk, a ThT kinetika, a Kongóvörös kettőstörés és a fibrilláris ultrastruktúra alapján (4A, B ábra). Érdemes megjegyezni, hogy a Spike194-203 peptidből hiányzik egy aminosav a megadott amiloidogén szekvenciából. A peptidben lévő ezen aminosav-deléció jelentőségének vizsgálatához egy egyszerű in silico mutációs kísérletet végeztünk, amelyben a Spike192 amiloidogén szegmensében az utolsó tirozint glicinnel helyettesítettük, hogy utánozzuk a deléciót. Az Y204G in silico szubsztitúció megszüntette az amiloid előrejelzést (S6. ábra), ami azt bizonyítja, hogy ennek az aminosavnak az eltávolítása megváltoztatja a peptid amiloidogén tulajdonságait. A fibrillumok "borotválása" számos amiloidogén fehérje és peptid esetében ismert. (25) Lehetséges, hogy az Y204 az S-fehérje aggregációja után hasad.
Ismert, hogy az S-protein az emberi vérben szerepet játszik a tartósan fennálló amiloidszerű mikrorögök képződésében, ami a tartós COVID19 tünetek egyik lehetséges kóros oka. (26) Elvégeztük a trombin indukálta fibrinogén-fibrin átalakulást, majd a plazminogén-tPA vizsgálatot (27) Spike peptidfibrillumok jelenlétében és hiányában (Támogató információk).
A hét Spike peptid (1. táblázat, S3 ábra) keverékéből képződött amiloid fibrillumok (10 μg/ml) hozzáadása a fibrinképződés során csökkentette a fibrinolízist (4C ábra). Továbbá a Spike192 és 194-203 2%-os fibrillumainak (1 mg/ml törzsből, összesen 20 μg/ml) hozzáadása növelte a perzisztens plazmin által nem emészthető fibrint (4. ábra D). A várakozásoknak megfelelően az amiloidogénebb Spike192 több plazminrezisztens fibrinrögöt indukált, mint a Spike194-203. Úgy tűnik, hogy redukcionista vizsgálatunk megismétli a humán plazmamintákból származó eredményeket. (7)
A pozitronemissziós tomográfiás (PET) amiloid-nyomjelzők két fluoreszcens analógját, a CN-PiB-t (a Pittsburghi B vegyület benzotiazol analógja) és a DF-9-et (a Florbetaben sztilbén analógja), amelyekről ismert, hogy kötődnek a neurológiai Aβ amiloidhoz és a szív AL, AA és ATTR amiloidhoz, és erős kötődést találtunk egyidejű fluoreszcens válasszal a Spike192 fibrillumokhoz in vitro (S7 ábra). Transzlációs stratégiaként a PET-képalkotás így a klinikai vizsgálatokban lehetőségként szolgálhat a folyadékbiopsziák kiegészítésére az amiloid mikrocsomók értékelésére. (26)
Összefoglalva, az alábbiakban egy egyszerű molekuláris mechanizmust mutatunk be arra vonatkozóan, hogy a NE által endoproteolitizált SARS-CoV-2 S-protein miként képezhet amiloidogén S-peptideket, például a 194-203-as szakaszt, és hogyan vezethet több amiloidogén szegmens expozíciójához a proteolitikusan bemetszett S-proteinben.
Lehetséges, hogy más amiloidogén peptidek és más proteázok által bemetszett S-fehérjék is érintettek lehetnek, ha ez a folyamat in vivo zajlik. Megállapítottuk, hogy az embert fertőző összes gyakori koronavírus tartalmaz amiloidogén szekvenciákat (S8A ábra). Ennek ellenére egyedül a COVID19 okoz ilyen változatos tüneteket, a korábbi típusoknál ezek nem jelentek meg. A 194-213-as szegmens egyedülálló a SARS-CoV-2 esetében (S8B ábra), ami az akut gyulladással és a neutrofil rekrutációval együtt, amelyről ismert, hogy a COVID-19-ben más vírusfertőzésekhez képest gyakoribb, magyarázatot adhat a feltételezett COVID-19-hez kapcsolódó amiloidképződésre. Meg kell említeni, hogy az amiloidózis meglehetősen gyakori az idős populációban (18), és a vírusfertőzésekkel való társulása vita tárgyát képezi. (13) A legújabb tanulmányok azt mutatják, hogy a COVID-19-ből felépült betegeknél megnövekedett a II. típusú cukorbetegség, egy amiloidhoz társuló betegség kockázata. (28,29) Bár vizsgálatunk a peptidek és fehérjék tiszta készítményeinek in vitro megállapításaira korlátozódik, az eredmények azt mutatják, hogy a COVID19 és a hosszú COVID19 tünetek vizsgálatakor az S-fehérje amiloidogenezist is figyelembe kell venni.”
Share this post