Ez a videó és az írás is azért készült, mert egy sorozatot tervezek a hagyományos oltásokról és azok hatásáról az emberiség jelenére és jövőjére. Viszont enélkül a bevezető nélkül a későbbi írások nem lennének “tudományosan megalapozottak” és sok esetben érthetőek sem. “Fősodor tudományon” alapszik, “megdönthetetlennek vélt tudományos axiomákon”, amelyeken el tudsz gondolkodni, vajon tényleg, mennyire bizonyítottak is azok és milyen mértékben védhetőek, és innen el tudsz kezdeni gondolkodni az egész mesterséges immunizáláson. A későbbi anyagaimban többször vissza fogok hivatkozni erre a videóra és írásra (de csak egy linkkel, vagy félmondattal).
Köszönöm, hogy megnézed a videót, hogy elolvasod azt írást, ha érdekelnek további anyagaim, akkor iratkozz fel a hírlevelemre, ha támogatni szeretnéd a munkámat, akkor akár elő is fizethetsz, mindamellett előfizetés nélkül is szabadon olvashatod, nézheted az anyagaim, viszont nem tudsz kommentelni.
Feliratkozni a "subscribe now" feliratra kattintással tudsz.Belátom, talán ez a videó és írás kicsit nehezebben emészthető, ezért írásban leközlöm most a vázlatát, vissza-vissza tudod olvasni, meg tudod nézni az alapul szolgáló videókat, anyagokat.
Éppen amiatt, mert a 2. pont az a vázlat, amiből alámondtam a videó szövegét, és ezt egyszerűen csak bemásoltam ide, így a második pont kevésbé lesz összeszedett, mint a megszokott írásaim.
Amire meg szeretnélek kérni az az, hogy - amennyiben van kedvetek és lehetőségetek - a következő, első pontot (ez nem a videó része) olvassátok el, mert ez segíthet a videó megértésében, és abban, mi motivált a videó elkészítésében.
1. Oltóanyagok, vírusok és fertőzés - az oltóanyagokban időnként fellelhető “idegen kódok”
1/A Oltóanyagok, vírusok és fertőzés (Ez a rész és ez a cikk nincs benne a videóban, ez a cikk indított arra, hogy utána nézzek, egyáltalán mik is azok a vírusok.)
Az egyik legelterjedtebb biológiai termék, amelyhez gyakran használtak egereket vagy egérszövetet, legalábbis az utóbbi évekig, a vakcinák, különösen a vírusok elleni vakcinák. Néhány, például a veszettség vírusa (Plotkin és Wiktor, 1978), a sárgaláz (YF) vírus (Frierson, 2010) és a japán agyvelőgyulladás (JE) vírusa (Inactivated Japanese Encephalitis Virus Vaccine, 1993) elleni vakcinák egéragyon tenyésztett vírusokból álltak. Ilyen vakcinákat 1931-től (YF-vakcina) egészen napjainkig (JE-vakcina, Japánban 1954 óta engedélyezett) használtak.
A veszettségvírus esetében a korai vakcinák főként kecske- vagy juhidegszövetből származtak. Emellett Dél-Amerikában és Franciaországban szopóegér agyból származó veszettségvírus vakcinákat is használtak (Plotkin és Wiktor, 1978). Az USA-ban soha nem engedélyeztek egérből származó veszettség elleni vakcinát (Dennehy, 2001). Az élő, hígított YF-vakcinákat eredetileg szintén egéragyon tenyésztették, de 1937-ben elérhetővé vált egy csirketojáson tenyésztett YF-vakcina (17D néven), amely azóta a választott vakcina volt Amerikában. 1962-ben Angliában és az USA-ban is kimutatták a 17D vakcina onkogén madárleukózis vírussal való szennyezettségét, de szerencsére nem jelentettek többlet rákos megbetegedést az oltottak között (Frierson, 2010). Franciaországban az egéragyból származó YF vakcinát még 1982-ben megszüntették.
Bár a fertőző betegségek megelőzésének és az életek biztonságának leghatékonyabb eszköze, a vakcinákkal kapcsolatban súlyos szennyeződési problémák is előfordultak (Pastoret, 2010). A nem rokon vírusokkal való szennyeződések, mint például a hepatitis B vírus (HBV) jelenléte az YF vakcinakészítményekben, amely az emberi szérum stabilizáláshoz való felhasználásából ered, valamint a majomsejtkultúrák felhasználásával a 40-es majomvírus (SV40) és a habos vírusok (Pastoret, 2010). Egyes vakcinavírusokat felhasználás előtt inaktiválnak, remélhetőleg inaktiválva ezzel a szennyező vírusrészecskéket is, de a szennyező vírus stabilabb lehet, mint a vakcinavírus. Az SV40 például rendkívül ellenálló az inaktiválással szemben (Murray, 1964). Az endogén retrovírusok a kontamináló vírusok egy külön osztályát alkotják, mivel ezeket a vírusokat egy adott faj minden sejtje kódolja, és ezért még szigorú szűréssel sem lehet őket elkerülni (Miyazawa, 2010). Az endogén madárleukózis vírusokkal való kontamináció komoly problémát jelent a csirkeembriókban vagy csirkeembrió fibroblasztokban tenyésztett vakcinavírusok esetében (Hussain és mtsai., 2003). Fertőző macska endogén RD-114 vírust találtak több macska sejttenyészetekben előállított állatgyógyászati vakcinában (Miyazawa és mtsai., 2010; Yoshikawa és mtsai., 2010).
A videó rövid összefoglalása és a leirata:
Köszönöm, hogy megnézed, hogy elolvasod, ha meg szeretnéd kapni a hírleveleimet, iratkozz fel, a subscribe gombra kattintással megteheted.1/B Ebben a részben a tudományos fősodor által elfogadott dolgokat és az általuk folytatott gyakorlatot ismertetem:
Vírusizolálás, sejt- és szövettenyésztés
A vírusok önálló életre nem képes dolgok, vagyis egy gazdaszervezet szükséges a szaporodásukhoz. Ennek megfelelően nem tudjuk őket táptalajon tenyészteni, Tenyésztésükre különféle rendszerek alkalmasak.
1. Állatoltás:
Főleg történeti jelentősége van
Problémák: nehéz fogékony állatot találni általában nem specifikusak a tünetek a kísérleti állatban jelen lehet látens (megbújó fertőzés, amiről nem tudunk) fertőzés Használatos állatfajok: egér, patkány, hörcsög, madarak, ritkán főemlős Fontos lehet az állat kora: a Coxsackie vírusok pl. csak szopós egerekben szaporodnak A vírusok oltási módja a vírustól függ: agyba (intracerebrális), hasüregbe (intraperitoneális), orrba (intranasalis) stb. is oltható az állat.
2. Embrionált tojás 7-12 napos, embrionált tojást használnak.
Sokfajta, de nem minden emberi vírus szaporítható bennük Fontos a tojás származása, olyan tenyészetből kell beszerezni, ahol nincs jelen a salmonella, campylobacter, madárleukémia vírus A csirkeembrió, zárt rendszer, immunológiailag inaktív Az egyes vírusok ideális oltási helye eltérő lehet: chorioallantois-membránra oltjuk a poxvírusokat és a herpesvírusokat amnionba oltjuk az influenzavírusokat és a mumpszvírust az allantois üregbe oltjuk a mumpsz a kanyaró valamit az adaptálás után az influenzavírusokat a szikhólyag alkalmas a különböző arbovírusok (ezeket a vírusokat különféle rovarok terjesztik) tenyésztésére Az embrionált tojással steril, aszeptikus (kórokozó mentes) körülmények között kell dolgozni. Az embrionált tyúktojást főleg a védőoltások előállításához szükséges vírus előállításához használják.
3. Sejtkultúrák primer tenyészetek és abból származó fibroblaszt:
Állati szervekből vagy emberi embriókból készítik A feldarabolt szövetdarabot tripszinnel (enzim) emésztik, majd a sejteket tápoldatba helyezik A sejtek kitapadnak a tenyésztőedény aljához és osztódni kezdenek, ez addig tart még elérik egymást, ezek után a kontakt gátlás miatt a szaporodásuk leáll. A sejteknek ugyanazok a tulajdonságai, mint az eredeti sejteknek Ezt követően a sejteket tovább passzálhatjuk, ez azt jelenti, hogy pl. tripszin segítségével leemésztjük a tenyésztőedényről a sejteket és centrifugálást követően friss tápfolyadékban nagyobb területű edénybe visszük át, ahol újra osztódhatnak. Így egy folyamatosan osztódó sejtkultúrát kaptunk. Amennyiben ez egy normális kariotípussal rendelkező szövetből indult, kb. 40-50 alkalommal tudjuk passzálni. Ezt követően a sejt elöregszik, nem képes további mitosisra. Az immortalizált sejtvonalak, korlátlanul passzálhatók Eredetük lehet: embrionális felnőttből eredő tumoros a kromoszómaszám változó, heteroploid sejtvonalak gyakran használt sejtvonalak: majom-veseszövetből: Vero, BSC-1 emberi méhnyakrákból: HeLa emberi gégerákból: HEp-2 Szuszpenziós sejtkultúra: emberi T-sejtes leukémia- vagy limfóma-eredetű sejtvonalakban is tenyésztenek vírusokat.
A vírusszaporodás jelei
1. Kísérleti állatokban az állatok az adott vírusra jellemző tüneteket mutathatják az állatok elpusztulhatna a vírus hatására ma is használják a Coxsackie A és B csoport elkülönítésére a vírust szopós egerekbe oltják az A csoport petyhüdt bénulást okoz (izomnecrosist) a B csoport spasticus bénulást (encephalitist)
2. Embrionált tyúktojás az embrió bizonyos vírusok hatására elpusztul (arbovírusok) a fertőzött membránon szürkésfehér csomócskák, pock-ok jelennek meg (herpes, poxvírus hatására) amniális folyadékból pl. az influenzavírus indirekt kimutatható hemagglutinációs próbával (a próba során az amniális folyadékot összekeverjük csirke vörösvértestekkel, ha a vírus jelen van azt agglutinálja, ha nincs jelen vírus a vvt-k egy idő után leülepszenek.
3. Sejtkultúrában A sejtekben a vírusra jellemző cytopathiás (sejtkárosító) hatás alakul ki A vírus hatására a sejtek zsugorodhatnak, lekerekedhetnek Többmagvú synthitiumok jönnek létre (herpes vírus) A sejtmagban szaporodó vírusok a magban hoznak létre zárványokat Couldry A típusú zárvány: Herpes simplex B típusú zárvány: feltöredezett: adenovírus A cytoplasmában szaporodó vírusok ott hoznak létre zárványt. Negri testek: rabiesvírus.
Állati sejt/szövettenyésztés:
Egészen más, mint a mikroorganizmusok tenyésztése.
A sejtvonalak egy része csak felülethez kötve növekszik (monolayer, kontakt gátlás)
→ speciális tenyésztő edények
Van néhány, ami szuszpenzióban is szaporodik (CHO, BHK, VeRo, HeLa), mint a mikrobák
→ fermentorszerű készülékek. Általában emlős sejteket tenyésztenek, de előfordul madár és rovar sejtek tenyésztése is.
A sejttenyésztés jelentősége
kutatás: az állati sejtekre jellemző biokémiai utak, különböző sejtszintű szabályozások
rekombináns fehérjék előállítása (pl. interferonok, növekedési hormonok, stb.)
monoklonális ellenanyagok (immunfehérjék) termeltetése (hibridóma sejtekkel)
vírusok szaporítására vakcinagyártás céljából
állatkísérletek kiegészítése, részleges helyettesítése.
A fenntartás korlátja:
A gerincesek legtöbb sejtje csak korlátozott számban osztódik az izolálást követően, azaz a tenyészet elöregszik (= szeneszcencia)
Okai:
1. a kromoszómavégek (telomérák) minden osztódási ciklusban bekövetkező megrövidülése
2. aktiválódnak a sejtciklust ellenőrző (és azt leállító) mechanizmusok Csak a tumor- és a rovarsejtek osztódnak korlátlanul (immortality).
Szaporítható sejttípusok: Szinte minden szövet szaporítható, az izom és ideg kevésbé. Az érett vérsejtek nem osztódnak. Fibroblaszt (kötőszövet): generációs ideje kicsi, felületeken gyorsan nő, túlnövi az egyéb szöveteket Epitheliális (hám) sejtek: sok specializálódott sejt van A korai embrionális eredetű sejtek jól szaporodnak Rágcsálók (pl. egér, patkány, hörcsög) sejtjei is.
A VÍRUSOK JELLEMZÉSE, ELNEVEZÉSE ÉS OSZTÁLYOZÁSA
Jellemzés
Vírusok
- legkisebb fertőző ágensek
- méretek: 20 nm (Parvovirus) 400 nm Poxvírus, Filovírusok hossza 10000 nm is lehet
- elektronmikroszkóppal tanulmányozhatók
- összetétel: nukleinsav (DNS vagy RNS), fehérje, komplexebb vírusok lipidek, szénhidrátok is
- élő, fogékony sejtekben tenyészthetők
Megjelenési formák:
-vegetatív vírus: gazdasejttel egyesült vírus (nukleinsav replikatív formában)
-virion: fertőző genetikai információ, fehérjeburokban levő géncsoport
sejtből kijutott vírusrészecske, meghatározott fizikai és kémiai szerkezettel
nem mutat életjelenségeket
megfelelő körülmények közott megőrzi fertőzőképességét
-provírus: a vírusgenom a gazdasejt genomjába integrálódott
Vírust meghatározó kritériumok
egyféle nukleinsavat tartalmaz
fogékony sejtbe jutva vírusnukleinsav irányítja a replikációt
a vírusnukleinsav csak a gazdasejt bizonyos bioszintetikus folyamatainak jelenlétében képes replikációra
nem képes kettéosztódásra
nincs saját riboszómája, önmagában nem képes a replikációra
A virus nem sejtes fertőző ágens, amely csak egyféle kódoló nukleinsavból és fehérjéből áll.
Elnevezés, osztályozás
- vírusrészecske nukleinsavtartalma alapján:DNS és RNS vírusok
- víruscsaládok: virion morfológiája és fiziko-kémiai szerkezeti jellemzők alapján
- további felosztás: antigénszerkezet, citotropizmus, fertőzött sejten belüli szaporodás helye,peplon felvétel helye,virion enzimtartalma alapján
- Nemzetközi Vírustaxonómiai Bizottság (ICTV)
- víruscsalád (familia): -viridae (Picornaviridae)
- alcsalád (subfamilia): -virinae (Alphaherpesvirinae)
- nemzetség (genus): -virus (Enterovirus)
Víruscsalád:
nukleinsav kémiai szerkezete (DNS vagy RNS), egyszálú vagy kétszálú, lineáris vagy cirkuláris
nukleokapszid szimmetriatípusa (helikális, kubikális vagy komplex)
burok (peplon) jelenléte vagy hiánya
helikális vírusoknál a nukleokapszid átmérője, kubikális vírusoknál a kapszomerek száma
Gerincesek orvosi vonatkozású vírusai: DNS vírusok (6 család), RNS vírusok (13 család)
DNS: Adenoviridae, Hepadnaviridae, Herpesviridae, Papovaviridae, Parvoviridae, Poxviridae.
RNS: Arenaviridae, Bunyaviridae, Caliciviridae, Coronaviridae, Filoviridae, Flaviviridae, Orthomyxoviridae, Paramyxoviridae, Picornaviridae, Reoviridae, Retroviridae, Rhabdoviridae, Togaviridae.
2. A videó leirata
(A videó végül nem ebben a sorrendben került összevágásra)
A föld nem remegett a lábuk alatt. Soha nem találtak vírusmaradványokat kőzetekben, tulajdonképpen nem is élőlények, hanem olyan fehérje- és genetikai információdarabkák, amiktől lehet, hogy talán pár napig szipogni fogsz, de rosszabb is lehet. És ezek a pici dolgok annak a bizonyítékai, hogy még a legapróbb dolgok is óriási hatással lehetnek az életre.
Azokról az apró genetikai betörőkről beszélek, amik körül forog mostanában minden. A vírusokról, amelyeknek nincs fosszilis nyoma, a tudomány szerint amiatt, mert túl kicsik és törékenyek ahhoz, hogy megmaradjanak.
A tudósok mégis azt mondják, hogy a vírusok fosszilis nyoma azok a gazdatestek, amelyeket megfertőztek, mert a megfertőzöttek DNS-ben megőrződnek, beleértve a te testedet is.
A vírusok sikerének kulcsa az egyszerűségükben rejlik. A vírusok apró genetikai információból, DNS-ből vagy RNS-ből állnak, amelyek egy fehérjekapszulába vannak csomagolva. Sokuk nagyon kicsi, nanométeres nagyságrendű, míg mások meglepően nagyok, de a fennmaradásuk és szaporodásuk érdekében arra van szükségük, hogy megfertőzzenek egy gazdatestet
A tudósok szerint a vírusok egyidősek az élettel, ezt amiatt feltételezik, mert az élet minden formáját képesek megfertőzni. Baktériumokat, az archeákat, amelyek sejtmag nélküliek, és az eukaruiótákat is.
Lépjünk be a paleo-virológia tudományába. Ez [00:01:00] egy fiatal terület a paleontológián belül, és egy másik feltörekvő tudományágra épül, ez a genomika. Ahhoz, hogy ősi vírusok nyomait keressék, a szakembereknek a gazdatest genomját kell tanulmányoznia.
Amiatt, mert a vírusok úgy működnek, hogy megfertőzik a gazdatestet, ott hozzáférnek ahhoz a gépezethez, amelyet a gazdatest a saját DNS-e szaporításához használ. A vírusok viszont eltérítik ezt a gépezetet azért, hogy saját magukat szaporítsák, hát ez elég szemétség.
A gazdasejt kénytelen új vírusokat gyártani, amelyek aztán elmennek, és új gazdatesteket keresnek, hogy megfertőzzék őket.
Kivéve, amikor a vírusok és a gazdaszervezet nem válik el egymástól. Előfordul, hogy a vírus genomja beépül a gazdasejt DNS-ébe, és amíg nem okoz olyan mutációt, amely károsítja a gazdasejtet, addig az a kis vírusinformáció ott lapul észrevétlen, akár a végtelenségig. És ha ez egy spermiumot vagy petesejtet képző sejtben történik, akkor a vírus genomja átadódik a gazdaszervezet utódainak a genom többi részével együtt. Így a vírusgenom egyfajta molekuláris kövületté válik.
A vírus olyan gyorsan mutálódik, hogy néhány száz év múlva már nem sok maradhat az eredeti genomból. Ha azonban beintegrálódik a gazdaszervezet DNS-ébe, akkor csak a gazdaszervezet genomjával együtt mutálódhat.
Vajon a vírusok élőlények?
Ahhoz, hogy megválaszoljuk a kérdést, hogy a vírusok élnek-e, meg kell állapodnunk az élet definíciójában.
Általánosan elfogadott, hogy az élet képes szaporodni, energiát termelni magának, stabil környezetet fenntartani önmagán belül, képes fejlődni.
Tehát a vírusok képesek szaporodni, de nem önmagukban.
Képesek változni, de nem képesek energiát termelni, és nem tudják szabályozni a belső környezetüket.
Ezért egy szürke zónában vannak, mivel egyes kérdésekre igen a válasz, másokra meg nem.
Akár azt is mondhatnánk, hogy a vírusok nem képeznek egy önálló ágat az élet fáján, hanem olyan indák, amelyek rátekerednek az élet fájára. Ez egy elegáns, de hátborzongató kép. De akárhogy is van, a vírusok itt vannak. Benne vannak a DNS-ünkben. Megbetegítenek minket, néha nagyon csúnyán.
Tehát nem tagadható, hogy eszerint a definició szerint, mind információ léteznek, és részei az életnek.
Ebben a virológia előadásban a vírusok izolálásáról, azonosításáról és tenyésztéséről szeretnénk beszélni. Hogyan azonosítjuk a vírusokat, miként izoláljuk őket egy víruskeverékből és hogyan tenyésztik azokat a laboratóriumokban.
Tehát maradjatok velem, hogy képben legyetek.
Tehát az a kérdés, hogy hogyan izoláljuk, tenyésztjük és azonosítjuk a vírusokat?
Mert, ahogy már az elején is láthattátok, ez a vírus dolog egy óriási terület, és a jelentős része mindezidáig ismeretlen előttünk.
Tehát nagyon fontos tudnunk azt, hogy pontosan hogyan tudunk izolálni, tenyészteni és azonosítani egy vírust.
És láthattuk, hogy a vírusok teljesen mások, nem hasonlítanak sem a baktériumokra, sem az eukariótákra.
Emiatt nagyon nehéz izolálni és tenyészteni őket, és egy teljesen más megközelítési igényel ez.
Tehát az alap az, hogy a vírusokat élő sejtekben kell tenyészteni, és mind közül ez a legnagyobb kihívás. Hasonlóan más organizmusokhoz tápanyagok kellenek, és a vírusok is tápanyagokat vesznek fel. De ha kémiai tápanyagokat adunk nekik, akkor nem fognak növekedni. Gondoskodnunk kell nekik egy gazdatestről. Ez egy élő sejt.
Tehát fenn kell tartanunk egy élő sejtet kell fenntartanunk ahhoz, hogy a vírus is fennmaradjon.
A bakteriofágok olyan vírusok, amik baktériumokon alakulnak ki. Így lehet a bakteriofágokat tenyészteni. Oké, tehát először is el kell készítenünk egy baktériumtenyészetet, nekik kell táptalaj, és aztán baktériumokat kell odatennünk, hogy a baktériumtáptalaj is elkészüljön. Aztán hozzá kell adnunk a bakteriofágot, hogy a baktériofág bemehessen a baktériumba és elkezdjen ott élni.
Az állati vírusokat lehet tenyészteni sejtkultúrában, embrionált tojásban, vagy akár élő állatokban is.
Tehát ez az, ami miatt a vírusokkal bánás sokkal nehezebb, mint a baktériumokkal.
A bakteriofágok a baktérium táptalajon képesek nőni. Ebben az esetben enzimekkel kezelnek szöveteket annak érdekében, hogy szétválasszák a sejteket, amiket aztán egy táptalajba kevernek, majd a normál sejtek vagy primer sejtek egy réteget fognak alkotni a táptalajon.
Tehát létrehozunk egy sejtréteget a petricsésze tetején, amibe befecskendezzük a minket érdeklő vírust, hogy lássuk hogy nő, hogy beazonosíthassuk és tanulmányozhassuk a vírust.
Hogyan azonosítunk egy vírust?
A vírusokat a gazdaszervezetre gyakorolt hatása alapján azonosítjuk.
Az első a gazdasejtben megjelenő sejtkárosító hatás alapján történő azonosítás.
Tehát így tudunk azonosítani egy vírust egy élő szervezetben.
Legtöbbször ezt csináljuk, amikor valaki megfertőződik egy vírussal, vannak neki tünetei, és ez alapján beazonosíthatjuk, milyen típusú a vírus.
Ezen kívül ott vannak a szerológiai tesztek, – a vérsavóból vagy más testnedvekből
a vírus elleni antitesteket;
vírus hemagglutinációs tesztet végeznek: pl. az influenzavírus indirekt kimutatható hemagglutinációs próbával (a próba során a folyadékot összekeverik csirke vörösvértestekkel, ha a vírus jelen van, a vörösvértestek összetapadnak, ha nincs jelen vírus a vörösvértestek egy idő után leülepszenek.
vagy Western blotot használunk arra, hogy kimutassuk a vírust.
Ezek "indirekt" tesztek - azaz az immunrendszer válaszát mérik egy fertőző ágensre, ahelyett, hogy magát a kórokozót keresnék. Bár a módszer kissé bonyolult, az alapelv egyszerű: a vizsgálat a betegtestnedveiben olyan antitesteket keres, amelyek reagálnak a kórokozó fehérjéire. Ha ilyen antitestek vannak a beteg vérében, akkor az az arra utal, hogy a beteg már kapcsolatba került a kórokozóval.
Keresik a vírushoz kapcsolódó specifikus fehérjéket. Tehát amikor egy olyan fehérje jelenlétét tapasztaljuk, amelynek egy eukarióta sejtben nem kellene jelen lennie, akkor azt feltételezzük, hogy az valamely vírusburokból vagy nukleokapszidból származik és biztosak lehetünk benne, hogy a beteg az adott vírussal fertőzött.
Kereshetjük a vírus nukleinsavait is.
Ehhez RFLP-t vagy PCR-t használnak.
A molekuláris biológia számos célra alkalmazza az úgynevezett polimerázláncreakciót (PCR) Ennek során felszaporítják az adott mintában található örökítőanyagot, azaz a DNS-t, amely így könnyebben vizsgálható. Amennyiben a vírus, amit keresünk RNS-vírusok közé tartozik, akkor először reverz transzkriptáz (RT) enzim segítségével DNS-t kell készíteni belőle, amit aztán a PCR folyamán fel lehet szaporítani.
Emellett az RFLP a Restrikciós Fragmentum Hossz Polimorfizmus módszerrel is kimutathatjuk a vírus genetikai ujjlenyomatát.
RFLP abban az esetben jelenik meg, ha a vizsgált DNS szálon található inszerció, deléció vagy SNP egy meglévő restrikciós helyet tönkretesz vagy egy újat hoz létre.
Ezen kívül az új módszerek, mint például a biofotonok és más technikák is használhatók, mint például az Elisa módszer, amelyik valamely testnedvből azonosítja azt a fehérjét, amely feltételezhetően csak a vírusból származhat.
Ez segít nekünk azonosítani a vírus jelenlétét egy gazdaszervezetben.
A mai videóelőadásban a vírusok tisztításának különböző módszereit fogjuk megvizsgálni. Tudjuk tehát, hogy a vírusokat sejtben vagy egy élőlényben, állatban, vagy egy embrióban is lehet tenyészteni.
Amikor kitenyésztettük a vírusokat a táptalajban, ahhoz, hogy alaposan tanulmányozhassuk őket, szükségünk van a megtisztított formájukra.
Tehát ahhoz, hogy a vírusokat megtisztítva, tiszta formában megkapjuk, tehát mentesek legyenek minden szennyező anyagtól, például sejtektől vagy sejtkivonattól, bizonyos technikákat kell alkalmaznunk, és most ezeket fogjuk megnézni.
Ezek közül a módszerek közül egyik sem biztos módszer, nem hülyebiztos, és egyetlen technika sem tekinthető a vírusok tisztításának arany standardjának.
Minden laboratóriumnak megvan a saját optimalizált, szabványosított technikája.
Megnézzük a jelenlegi technikák alapjait, azokat, amelyeket az iparban alkalmaznak. Az iparban általában a technikák kombinációját használják, hogy jobb eredményeket és tiszta kivonatokat kapjanak.
Négy technikát vizsgálunk meg:
Ultracentrifugálás
ultraszűrés
kicsapatás
kromatográfia.
Ezt a négy technikát fogjuk megvizsgálni.
Tehát az első az ultracentrifugálás. Ez egy speciális technika, amely a minták megpörgetésére vagy a minta nagyon nagy sebességgel történő mozgatására szolgál, akárcsak a normál centrifugálásnál, itt is az a cél, hogy az oldatban lévő komponenseket szétválasszuk a méretük és a sűrűségük, a közeg viszkozitása vagy a közeg vagy az oldószer sűrűsége alapján.
Ha egy oldatot hosszú ideig szobahőmérsékleten tartunk, akkor a részecskék a gravitáció miatt le fognak ülepedni, mert a gravitáció lefelé húzza őket.
Viszont ha nagy sebességgel pörgetjük ezeket a részecskéket, akkor a centrifugális erő megnöveli az ülepedés sebességét. Tehát az ülepedés a gravitáció hatására természetes módon is bekövetkezne, de ez nagyon lassú és időigényes. Tehát a centrifugális erővel megnöveljük a leülepedés sebességét.
Ezt úgy lehet elérni, hogy nagyon nagy sebességgel, 10 000 fordulat/perc, 40 000 fordulat/perc sebességgel pörgetjük a mintát. Az RPM itt percenkénti fordulatszámot jelent. Tehát jelenleg vannak olyan ultracentrifugák, amelyek akár egy perc alatt 50.000 fordulatot is tudnak pörgetni, vagy egy perc alatt 50.000 fordulat/perc.
Nos, hogyan segít ez? Mi itt azt csináljuk, hogy a vírust tartalmazó mintát beletesszük az ultracentrifugába, és ezen a nagyon nagy sebességen pörgetjük, hogy a részecskék külön választódjanak, és a kivonat leülepedjen, és így elválasztjuk a vírusmintáinkat.
Tehát kapunk, uh, supernatánt, azaz a folyékony formát, az oldószert, ami felül van, és kapunk egy pelletet, ami alul van. Most itt az történik, hogy amikor ilyen nagy sebességgel, ilyen extrém nagy centrifugális erővel pörgetjük, az mindenképpen túlmelegedést okoz, és ez károsíthatja a mintát, a vírust.
Ezért az ultracentrifugákat általában vákuumrendszerrel szerelik fel, amely biztosítja, hogy a centrifuga rotorjában állandó legyen a hőmérséklet. A hőmérsékletet folyamatosan fenntartják.
Mindháromnál lesz egy hűtőrendszer is. Tehát a vákuum és a hűtés segít abban, hogy ilyen nagy sebességet használjunk anélkül, hogy az adott részecske vagy a vírus károsodna.
Tehát ez az ultracentrifugálás.
Szóval, amit itt csinálunk, az a következő. A hagyományos centrifugával szemben ez további előnyt jelent, mivel a forgási sebesség sokkal nagyobb, és mivel a vírusok nagyon apró részecskék, ilyen nagy sebességgel kell őket pörgetni, hogy külön szedjük őket és elkülönítsük egymástól őket.
Az ultracentrifugákat a 1990-es évek elején fejlesztették ki, és különböző sejtkomponensek differenciált elválasztására használjuk, nem csak vírusok, hanem akár szervek, vagy a lipidmembrán elválasztására, sőt a DNS és az RNS tisztítására is. De van két fő módszer, amit ma vírusoknál használnak, amit itt mutattunk be.
Az első a differenciál centrifugálás.
Ez egy nagyon gyakori eljárás, amely a részecskéket azok ülepedési sebessége alapján különíti el. Itt a különböző fragmentumok különböző méretűek, különböző sűrűségűek. Tehát minden egyes töredék különböző minimális centrifugális erővel fog leülepedni a pelletbe.
Vagyis minden egyes alkalommal, minden egyes pörgetésnél folyamatosan növeljük a centrifugális erőt. Tehát a mintát rétegekre választjuk szét, a különböző sebességű centrifugálással.
Minden egyes alkalommal, amikor centrifugálunk, egy adott részecske adagot kapunk a mintából, és ezek mérete minden egyes pörgetéssel csökkenni fog. Tehát ahogy itt láthatjátok, először a nagy méretű zöld részecske ülepedett le. Aztán jöttek a piros színűek, a kék, és végül a fekete színű.
Általában a vírusok a legkisebb részecskék az oldatban, és nekik tart a leghosszabb ideig, amíg leülepednek.
Tehát itt azt kell tennünk, hogy a minta szétválasztását különböző rétegekre kell elvégeznünk a centrifugális erő következetes növelésével.
Tehát gyengébb centrifugálással az üledékben a nagyobb részecskék és sejtek vannak, ahogy folyamatosan növeljük a centrifugális erőt, a különböző sűrűségű anyagok kiválasztódnak, minden egyes alkalommal a különböző sűrűségű részek elkülönülnek, kicsapódnak.
Ahogy a centrifugálását ismételgetjük, úgy különféle rétegek alakulnak ki.
Minden rétegnek más sűrűsége lesz, és így tudjuk ezeket elválasztani, elkülöníteni.,
Tehát a centrifugális erő fokozatos növelésével az összes, egyre kisebb méretű részecskét elválasztjuk.
Ez tehát a differenciál centrifugálás, ami egy elég egyszerű centrifugálási módszer avírusok kinyerésére ebben a PR formában.
A második típus a sűrűség gradiens ultracentrifugálás
Ez valamivel jobb, ez a részecskéket a sűrűségük alapján segít elkülöníteni.
Tehát itt már nem csak a méretről van szó. Ezzel a hasonló méretű, de különböző sűrűségű részecskéket is szét tudjuk választani
A sűrűség megváltoztatásához oldószert adunk hozzá, viszkózus folyadékot, például glicerint vagy szacharózt is használhatunk, és ezeket adjuk a mintához, és összekeverjük a vírus mintával ezeket. Használhatunk céziumot, sót, gradienseket, tehát a sűrűség alapján, az anyag ülepedési tulajdonságai alapján fogjuk elkülöníteni a részecskéket.
A vizsgálat során pl. cézium-kloridból gradienst hozunk létre a centrifugacsőben. Az alacsony sűrűségű felszínre rétegezzük a mintát. A centrifugálás során minden komponens csak addig a térrészig ülepedik, amelynek sűrűségével a saját sűrűsége éppen megegyezik. Ekkor az adott komponensre nem hat eredő erő, így „lebegni” fog - az egyes komponensek elválaszthatók a méretüktől függetlenül, kizárólag a sűrűségük alapján.
A differenciál centrifugálás módszerénél tehát semmiféle plusz anyagot nem adunk a mintához, e részecskék szétválasztása kizárólag a centrifugálási sebesség növelése alapján történik, nem használ semmiféle gradiáns oldatot. Ez a különbség a két módszer között.
A következő módszer az ultraszűrés
Ez egy hasznosabb módszer, mert nem károsodik a vírusrészecske, nem keletkezik hő. Emiatt gyakran használják a vírusoknak az oldatból történő kivonására.
Tehát van egy mintánk, oldatunk, amelyben különböző méretű részecskék vannak. Egy szűrőt, egy membránt használunk, amely nagyon sűrű, így képes visszatartani a nagyobb részecskéket, de átengedi a vírusokat. Tehát amikor az oldatot áteresztjük a szűrőn, a nagyobb méretű részecskék fennakadnak a szűrőn, míg a kisebb méretű vírusok átjutnak. Így ezeket használhatjuk a tisztításra, és tanulmányozhatjuk őket. Ehhez olyan szűrőt kell használnunk, amelynek rendkívül kicsi a pórusmérete. Ezek különböző membránok.
A harmadik a kicsapással történő izolálás
Nos, a kicsapást kristályosításnak is nevezik, és ez az egyik leghatékonyabb módszer a vírusok tiszta formában történő kinyerésére. Általában a kicsapással kezdjük, először kicsapjuk, és utána jön az ultraszűrés vagy az ultracentrifugálás.
Ebben vegyszereket használunk, mint például etanol vagy ammónium-szulfát, amelyekkel átitatják a mintát, és ezek segítenek a vírusok kivonásában.
Tehát arra van szükség, hogy a vírus kicsapódjon. Ezt ezekkel a vegyszerekkel, vagy kalcium-foszfáttal, alumínium-szulfáttal érjük el, de akár PEG – polietilénglikol is használható, a PEG-et egyébként nagyon gyakran használják a vírusok kicsapására.
A PEG a leghatékonyabb egyébként, ezzel érhető el a legjobb eredmény a vírusok kicsapására, hatékonyabb lesz az ultracentrifugálás.
Tehát hozzáadjuk a vegyszert a mintához, a PEG-et mondjuk és aztán elvégezzük a centrifugálást.
És látjuk, ahogy a vírus kiválasztódik az oldatból, ezt nevezzük kicsapódásnak.
Kijön az oldatból. És ez hogyan történik? Azért, mert ezek az oldatok, vagy ez a polietilénglikól, amit hozzáadtunk, megváltoztatja a vírus oldhatóságát, és a vírusok már nem maradnak az oldatban. Kijönnek az oldatból, és ez az, ami itt látható ezen az ábrán. Ez tehát a kicsapás, a vírusok tisztításának egyik leggyakrabban választott technikája.
Az utolsó módszer a kromatográfia.
A kromatográfia egy olyan technika, amelyet általában részecskék keverékének elválasztására használnak, és azon az elven alapszik a vírusok izolálása során, hogy a vírusok megtapadnak, vagy beleolvadnak bizonyos membránokba.Tehát veszünk valamilyen szilárd anyagot, membránt, amire a vírus hozzáragad, vagy beszívódik az anyag felületére, ahonnan később kit tudjuk azt vonni.
Az egyik leggyakrabban használt kromatográfiás technika az ioncsere, de lehet abszorpciós, affinitáskromatográfiás, méret-, kizárásos kromatográfiás.
Az ioncserélő kromatográfia az egyik legszélesebb körben használt módszer a vírusrészecskék és más, biológiai molekulák kiválasztására.
A módszer a vírus töltésén alapszik. Tehát ha az anyagot úgy választjuk ki, hogy az a vírussal ellentétes töltéssel rendelkezzen, akkor amikor a mintát ráeresztjük, akkor a vírus rátapad annak a részecskének a felületére.
Tehát a vírus izolálása az oldatból az ellentétes töltésen alapul a vírusnak. Ellentétes töltést használunk, hogy izoláljuk a vírust az oldatból. Amikor elértük, hogy megtapad a vírus az anyag felületén, akkor Magnéziumkloriddal, vagy sót adunk hozzá és a vírus leválik az anyagról. Tehát amit itt csinálunk, az az, hogy először a vírust a mátrixra ragasztjuk, majd a mátrixból kiszedjük, kémiai anyagok hozzáadásával, és a végén az oldatunk csak a vírusrészecskéket fogja tartalmazni.
Források:
Külön szeretnék köszönetet mondani Szakács Árpádnak, aki kiadta Judy Mikovitz könyvét, “A korrupció pestise” címmel, javaslom elolvasni azt is, ez a könyv volt az, ami elindította bennem a “vezérhangyát”, hogy elkezdjek kutakodni a témában.
https://ttk.elte.hu/dstore/document/851/book.pdf
https://ttk.elte.hu/dstore/document/865/book.pdf
http://web.med.u-szeged.hu/medmicro/dok/fresh/20180531/virusizolalas.pdf
https://sotepedia.hu/_media/fok/targyak/mikr_virusok_-_osszefoglalo.odt
http://real-d.mtak.hu/1155/7/dc_1577_18_doktori_mu.pdf
Retrovírusok:
Vírusok tenyésztése:
Vírusok tisztítása:
Vírusok tisztítása:
Vírusok izolálása:
Sejtkultúrák növesztése:
Tojás:
video, hogy csinálják – lejátssza:
hogyan csináljunk adenovirusvektort?
https://www.youtube.com/playlist?list=PLmxVzBdIHVmLlfQH-DK2N4esPavo9JkhK
https://www.lymedisease.org/assets/Understanding-Western-Blot-Lyme-disease-test.pdf
https://ttk.elte.hu/dstore/document/865/book.pdf
https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/16951744/
Zene:
Share this post